通过整合空间转录组学图谱实现单细胞注释与定位：解析小鼠眼表图谱及RAO动态

　　视网膜动脉阻塞(RAO)作为临床高发的致盲性眼科急症，疾病进程伴随缺血缺氧损伤、神经元病变与免疫应答紊乱。眼球组织具备精细的层状解剖结构，传统单细胞转录组技术可解析细胞异质性，却丢失关键空间位置信息;常规空间转录组技术又存在细胞分割偏差、捕获效率不足、实验成本高昂等问题。如何利用有限的空间测序样本，实现大规模单细胞数据的精准注释与空间定位，是眼部空间图谱构建、RAO 病灶动态机制研究中亟待突破的技术难题。

　　为解决上述瓶颈，武汉大学研究团队开发了ASCAL分析流程，融合SeekSpace和Stereo-seq两大平台展联合解析：依托具备单细胞分辨率的 SeekSpace 构建高可信度细胞表达参考图谱，结合 Stereo-seq 覆盖面广、视野完整的特点补充全域空间定位信息，再串联 eClassifier、CytoSPACE、TopACT 等算法，实现海量单细胞数据的自动化分型与空间定位。基于这套技术体系，研究完成了目前覆盖最全面的小鼠全眼单细胞空间图谱绘制，并深度剖析 RAO 模型的空间病理特征，为眼部生理、病理研究以及致盲性眼病的靶向治疗，提供了全新的组学研究工具与核心基础数据。

　　本研究由武汉大学生命科学学院博士生杜辰、李胤铭博士、硕士生李紫玥作为共同第一作者，武汉大学人民医院肖璇教授和武汉大学生命科学学院周宇教授为共同通讯作者。

　　图1、小鼠眼部单细胞分辨率空间转录组分析概述

　　双平台融合，破解空间组学技术难题

　　眼球组织具备精细的层状解剖结构，传统单细胞转录组技术虽能解析细胞异质性，却丢失了关键的空间位置信息;而常规空间转录组技术又面临细胞分割偏差、捕获效率不足、实验成本高昂等瓶颈。如何在不增加大规模空间测序负担的前提下，实现海量单细胞数据的精准空间定位，一直是眼部疾病研究中的技术难题。

　　研究团队创新性地开发了ASCAL分析流程，融合SeekSpace与Stereo-seq两大空间组学平台的优势：依托SeekSpace构建单细胞分辨率的高可信度细胞表达参考图谱，结合Stereo-seq覆盖面广、视野完整的特点补充全域空间定位信息，再通过eClassifier、CytoSPACE、TopACT等算法串联，实现高通量单细胞数据的自动化分型与精准空间定位。

　　基于该技术体系，研究团队仅利用3张小鼠眼部冷冻切片，即成功捕获17,835个细胞，构建起单细胞分辨率的眼部空间参考图谱，共注释出17类细胞类型，涵盖6类视网膜神经元、3类胶质细胞以及晶状体、睫状体等标记基因稀缺组织的细胞群体。空间邻域富集分析证实，该图谱能够精准复现视网膜突触层、角膜基质上皮复合体等原位空间排布特征。

　　图2、基于SeekSpace参考数据对小鼠眼不同区域单细胞进行自动化细胞类型注释

　　精准识别"隐藏"细胞，避免假性富集

　　研究进一步证明，基于SeekSpace空间图谱构建的SVM自动分型模型eClassifier，可有效规避人工标记基因注释的主观偏差，实现跨眼部区域的无偏细胞鉴定。在针对RAO病理模型的分析中，eClassifier成功识别出常规无监督聚类无法单独分群的Müller胶质细胞——该类细胞与无监督聚类的Jaccard相似度最高仅为0.04，凸显了精细分型算法在解析转录特征微弱差异细胞类型上的独特优势。

　　针对眼球中弥散分布的稀有外周免疫细胞，研究团队采用TopACT概率化定位技术，结合CD14免疫荧光验证，证实外周免疫细胞主要富集于眼外肌及结缔组织，在视网膜区域几乎无阳性信号，精准符合血视网膜屏障的生理规律，有效避免了稀有细胞在视网膜区域的假性富集。

　　图3、基于Stereo-seq技术的单细胞空间定位重建

　　揭示RAO空间特异性损伤机制

　　在RAO病理模型研究中，ASCAL体系展现出强大的空间解析能力。研究证实，RAO引发的免疫活化存在显著的空间分布偏好：Müller胶质细胞标志物Vim在造模后3天即于视网膜神经节细胞层(GCL)出现表达上调，7天时GCL与内核层(INL)表达进一步升高;小胶质细胞富集热点数量较对照组提升10倍以上，且主要定位于GCL，并呈现突起粗短、分支减少的典型活化形态。

　　更为关键的是，研究首次发现RAO对视杆细胞的损伤具有亚群选择性。借助SeekSpace的单细胞空间分辨优势，团队鉴定出5个视杆细胞亚群，其中位于视网膜外周、具有高翻译活性、Rbp3阳性的C1功能型亚群在RAO造模后占比显著降低，阳性细胞数量近乎减半。这一发现打破了"RAO造成视杆细胞整体性损耗"的传统认知，揭示了疾病对特定功能亚群的选择性攻击机制。

　　图4、RAO诱导的免疫激活空间定位分布

　　为致盲眼病研究奠定数据基础

　　研究团队表示，ASCAL整合分析体系的核心价值在于突破了单细胞与空间转录组数据联合解析的技术瓶颈——无需大规模空间测序实验，仅依托少量组织切片，即可完成高通量单细胞数据的精准注释与空间定位。这一方法不仅适用于眼部研究，也为其他具有复杂空间结构的组织器官研究提供了可借鉴的技术范式。

　　该研究构建的小鼠眼球全域单细胞空间图谱，将为眼部发育、生理功能研究提供高分辨率、完备的基础数据集;而RAO模型中揭示的空间特异性免疫激活及视杆细胞亚群选择性损伤特征，则为急性致盲性视网膜血管病变的早期诊断标志物发现与新型靶向治疗策略开发奠定了坚实的理论基础。