以毒攻毒，病毒学家在行动！（1）

Fighting Viruses with Viruses.

The virologists are in action!

前言：

在网上看到一个母亲的帖子：她的儿子问“是否可以造一个病毒的病毒？”

这个问题近期在一个名为“疫苗精英”的微信群中引起许多知名病毒学家的关注。多位专家都表示小孩的天真问题其实很有意思。

有的专家还结合自己的专长介绍植物病毒会有卫星病毒或者卫星RNA，后者依赖前者复制，曾经被用来防治植物病毒病害，基本上可以看作病毒的“病毒”。

法国巴斯德研究所的研究人员马尔科 维纳乌兹（Marco Vignuzzi）等一直在探索各种病毒在感染细胞时产生的DVGs（缺陷病毒基因组，defective viral genomes） 的抗病毒潜力。他们证明：某些病毒的DVGs可以干扰野生型病毒在哺乳动物细胞中的复制。

DVGs也可能抑制范围广泛的多种病毒。DVGs具有免疫刺激潜能，在人体内的存在与流感病毒、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒和登革病毒感染后疾病症状较轻和预后较好相关。

维纳乌兹（Vignuzzi）和同事在后续研究中发现了具有最佳干扰活性的DVGs，研究结果发表在去年的Nature Communications>上。基于这些结果，法国巴斯德研究所与法国生物技术公司Meletios Therapeutics目前正在着手联合开发一种针对寨卡病毒（Zika virus）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）的新型抗病毒药物。

病毒的基因组在复制过程中也会犯错误，特别是RNA病毒，它们在复制过程中不像DNA病毒那样具有纠错功能，因此犯错的机率更大。病毒基因组的复制错误会导致基因组序列的缩短和/或重新排列，这样产生的序列被称为缺陷病毒基因组（defective viral genomes，简称DVGs)。由于DVGs通常缺乏复制和形成新病毒颗粒所需的关键元素，含有DVGs的病毒粒子只有与相应的全长(即野生型)病毒一起感染细胞时才能完成复制周期。为了复制它们的基因组，DVGs 经常从野生型病毒中劫持自身缺失的蛋白质，这一现象可以导致野生型病毒复制的抑制。越来越多的证据表明，这种抑制可以用于开发抗病毒药物。

法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）的马尔科 维纳乌兹（Marco Vignuzzi）一直在探索这一想法，他研究各种病毒在感染细胞时产生的DVGs 的抗病毒潜力（参考文献１）。为了捕获在细胞培养中形成的DVGs , 维纳乌兹和他的同事用基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）感染哺乳动物和蚊子的细胞，基孔肯雅病毒是一种蚊子传播的病毒，会导致类似于登革热病毒引起的症状。然后，他们从细胞中分离出新出现的病毒粒子，并用这些粒子感染新细胞――采用系列传代技术进行10次算一个周期（cycle）。对最后传代分离的病毒基因组进行测序和定量分析发现，从第一代到最后一代，DVGs的数量增加了约10万倍。最常见的DVGs被分为四组，每组中DVGs的缺失大小相似，基因组位置相似。其中3组主要来源于哺乳动物细胞，第4组主要来源于蚊虫细胞。

为了确定DVGs是否也在受感染的节肢动物中产生，这组作者通过让埃及伊蚊吸食受病毒感染的血液，让它们感染了基孔肯雅病毒。感染10天后解剖蚊子，分离总RNA，采用DVGs特异性引物对RNA进行测序鉴定。该分析表明，在蚊子体内产生的DVGs与在细胞培养中产生的DVGs具有相似的缺失模式和图谱，表明DVGs在细胞培养和蚊子体内都可以产生。

所有后续的研究都使用了20种来自哺乳动物和蚊子的DVGs，这些DVGs发生频率最高，并在所有传代中都持续存在。为确认DVGs确实是有缺陷的,无法在缺乏完整病毒的情况下在一个细胞内复制,作者引进(即转染)为每个DVG编码的RNA分子到哺乳动物细胞，在感染后8、20、28和44小时从细胞中提取总RNA。然后使用分别对各个DVG特异的引物对DVGRNA 进行PCR定量。研究人员观察到,与对照细胞中观察到的野生型病毒水平随时间而稳步增加相比，DVG水平在所有时间点上都减少了。这一发现证实，在没有野生型病毒存在的情况下，DVGRNA未能进行复制,反而随着时间的推移而降解。

为了观察这20种DVGs是否真的干扰了野生型病毒的复制，作者将一种编码DVG的RNA和一种编码全长荧光标记野生型基孔肯雅病毒的RNA以1:1的比例转染哺乳动物细胞，这样他们可以通过荧光显微镜在不同时间点监测野生型病毒的存在。与大多数DVGs编码RNA一起转染的野生型基孔肯雅病毒在转染48小时后仍能发出强烈的荧光，表明大多数DVGs按1:1比例转染后并没有抑制或减少野生型病毒的复制。然而，当DVG/全长病毒的比例增加到10:1时，全长基孔肯亚病毒的荧光降低了10 ~ 1000倍，而几乎所有的DVG都仍然存在。这表明大多数DVGRNA的较高比例增加了这些基因组从野生型病毒中没收复制所需元件的可能性，从而干扰了它们的繁殖。有趣的是，最小的、缺失最多的DVG似乎并没有干扰野生型病毒的复制，可能是因为这种基因组缺失了太多的元素，不能被全长病毒的存在充分补偿。总之，这些结果表明，哺乳动物细胞和蚊子细胞来源的DVGs都可以干扰野生型病毒在哺乳动物细胞中的复制。值得注意的是，当在蚊子细胞中重复这个实验时，大多数可以抑制哺乳动物细胞中野生型病毒复制的蚊子细胞衍生的DVGs在蚊子细胞中无法做到这一点。虽然产生这种效应的确切原因尚不清楚，但可能是节肢动物传播的病毒在蚊子中流行，导致这些病毒在蚊子中进行复制的过程中进化出了对DVGs效应的一些耐受性。

(未完待续）

参考文献：

1. Levi LI, Rezelj VV, Henrion-Lacritick A, Erazo D, Boussier J, Vallet T, et al. (2021)Defective viral genomes from chikungunya virus are broadspectrum antivirals and prevent virus dissemination in mosquitoes.PLoS Pathog17(2): e1009110. Published: February 8, 2021, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009110

3.Institut Pasteur, NEWS, 2022.02.28,SIGNING OF AN EXCLUSIVE LICENSE AGREEMENT BETWEEN THE INSTITUT PASTEUR AND MELETIOS THERAPEUTICS FOR THE DEVELOPMENT OF A NEW CLASS OF ANTIVIRALS，https://www.pasteur.fr/en/signing-exclusive-license-agreement-between-institut-pasteur-and-meletios-therapeutics-development